概要
いちから株式会社（現・ANYCOLOR株式会社）の「にじさんじプロジェクト」によって2018年2月にオーディションが開催され、翌3月より活動を開始。
早い段階でオーディションが行われたため、実は1期生との芸歴の差はほんの数ヶ月程度。1期生オーディションでは落ちたが2期生として受かったという者も多い。
2018年末における「にじさんじ（1期生・2期生）」「にじさんじゲーマーズ」「にじさんじSEEDs」の統合を受けて「2期生出身」「元2期生」と称されるようになった。
メンバー
剣持刀也（けんもちとうや）
16歳の高校2年生。剣道部所属の隠れまじめ系男子。普段は周りと合わせてじゃれているがダメな時はダメという。以前から他の人の配信を見るのが好きで、その憧れから始めた。
練習のしすぎで怪我が絶えないので、常に救急セットを持参している。
リスナーからの扱いの悪さに定評があり、彼の元に届くマシュマロはファンレターというよりも怪文書のような内容のものばかり。それらを巧みなトークで次から次へと容赦なく捌いていく様子が面白がられ、この界隈に「クソマロ芸」の概念を確立。
彼のそれは質・量ともに圧倒的（2021年9月の時点で40万個）であることから「クソマロの王」として君臨し続けている。(2023年5月に、遂にマシュマロ数が100万を超えた)
伏見ガク（ふしみ がく）
20歳の大学2年生。普段はアルバイトやサークルのバンド活動に勤しむ。性格は犬っぽく純粋に楽しいことが大好き。いろんな人とお喋りしたくて配信を始めた。チャラそうに見えるが周りの人を気遣ったりと優しい。楽しんでなさそうな人がいると「楽しんでる？」と声をかけたりする。
ホラゲーをよくプレイする。…のだが、普通の人が思わず叫び声を上げてしまうようなびっくり・恐怖シーンであまりにも動じない（あるいは何故か爆笑する）ため、ガクのホラゲー配信は「あまり怖くない」「ガクくんの方が怖い」と評判で、こういったゲームが苦手な人にも入門としてオススメ。
ギルザレンⅢ世（ぎるざれんさんせい）
年齢4000歳のヴァンパイア。人里離れた山奥の豪華な城に住んでいる。
同族の中でも高位に属する身分で、他者に対する言動も尊大で高圧的。しかし、一方で根は気が弱く、相手に不用意に近付かれると露骨にパニくってしまうヘタレ性な一面もある。
根っからのVtuberファンであり、「どこにでもいる」と評判になる（？）ほど様々な配信のコメント欄に姿を見せるが、自身はあまりにも配信をしなさすぎて（2021年10月時点でアーカイブは33個）、名前こそ知っているが声は聞いたことがないというリスナーも多い。
文野環（ふみの たまき）
日中は寝てばかりいるが、自分の縄張りを守るため一日数回散歩する。
縄張りにくる者には一度襲いかかる。縄張りを奪う気がないとわかると、優しくなり道案内をする。そして猫缶を要求してくる。道端でスマホを拾ったらしい。
活動当初の名前は「野良猫」だったが、後にTwitterで視聴者投票を行い名前が決定した。
宇志海いちご（うしみ いちご）
8歳の小学3年生。海辺の町に住んでいる、イチゴミルクウミウシの女の子。
お転婆でハツラツとした性格で、毎日学校帰りに海に潜って遊んでいる。
好物は桃色のワカメと、いちご味のお菓子全般。
夕陽リリ（ゆうひ りり）
16歳の高校1年生。未来人の女の子。
悪戯好きで、よくいろんなことをやらかす。現代の電波をジャックして、悪戯の一環として配信をはじめた。笑いの沸点が低くあらゆる場所にツボがあり、にじさんじ屈指のゲラ。
「性別:リリ」と言われることもあるイケメンであり、またイケボの持ち主でもあり、多くの女性ライバーを堕としてしまう女たらしの一面も。
鈴鹿詩子（すずか うたこ）
画面の向こう側の世界のチビっ子たち人気絶大のカリスマ的「うたのおねえさん」。子供向け番組で歌やことば遊びを披露している。飾らないルックス、安心感を与える歌声から親世代からの評判も良い。
婚期を逃すのでは(実は今年で26歳)と密かに危機感を抱いている。
…という公式紹介文とはなんだったのか、初回配信にて古の腐女子であること、ショタコンであることをカミングアウト。BLゲームを実況配信してYoutubeにBANされたり、度重なる下ネタで凍結の危機に陥っている。
物述有栖（もののべ ありす）
16歳の高校1年生。転校を繰り返すが、別に帰国子女と言うわけでもない。 母がイギリス人、父が日本人のハーフだが、日本生まれ日本育ちのの生粋の日本人。
目立ちがり屋でこの容姿を生かして、わざと外国人っぽく振舞っている。
家長むぎ（いえなが むぎ）
15歳の中学3年生。学校はたまに行くが基本的にはひきこもっている。ゲームとお兄ちゃんが大好き。
実は髪の毛がプリンになっているのを気にしている。しかし外が怖いので美容室に行くことができない。
森中花咲（もりなかかざき）
10歳の小学4年生だけど大人に変身する。大人の姿で相手を困らせてからかうことも。
元気で活発的な女の子でクマと可愛い物が好き。
普段は甘える立場だが、たまに大人っぽい一面もあり甘えさせてくれる。
元々は1期生としてのデビューが予定されており、唯一の2期生シークレット枠デビューとなった。
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