　運用は中屋橋駅を境に都心寄り、木屋寄りに分けることができる。都心寄りではアセラ東潮線と競合関係にあり、宇野田〜柊口間の複々線（宇野田〜潮浜の片複線は港場線用）をはじめ急行や快速等多くの種別が運転される。逆に木屋寄りはローカル輸送が中心となり、アセラ木屋線と競合しているものの、海沿いを走るアセラに対し木急は内陸部を走るため中屋橋及び都心寄りから木屋まで直通する優等列車が直接の競合となる。

　木屋本線の小川浜駅及び木屋加駅にはそれぞれ小川浜検車区、加検車区が併設される。小川浜検車区は8連を中心とした一般車と地下鉄直通車が所属し、多くの4連普通車及び特急車は加検車区に所属する。大規模な検査は加検車区が担当する。

その他の社内の路線の乗り換えは後述。

港場線

木屋浜本線の宇野田駅から海前駅までの路線。駅数は9。宇野田〜潮浜間は木屋浜本線に直通し（複線の内片側は港場線用）全列車が潮浜駅から発車するほか、木屋浜本線柊口まで直通する列車も一部存在する。都心東側下町エリアを南北に縦断し、乗り換え路線も多いのが特徴。

柊浜線

木屋浜本線の柊口駅から柊浜駅までの路線。駅数は16。路線図では省略されているが、柊口駅から北に分岐し、穴井駅を経由した後に東面鳥駅で木屋浜本線に合流。その後面鳥駅から今度は南に分岐し柊浜駅を目指すという少々ユニークなルートを取る路線。90年代後半より進められた線路改良の結果、面鳥・永渡で系統分離がなされ、面鳥以西、特に穴井以西において対海都のアセラ線と競合する通勤路線となった。南港快速が都心部〜穴井の輸送を受け持つほか、朝晩には通勤快速も運転される。一方で面鳥・永渡以東は木屋浜本線と平行していることから利用客の減少が進み、各駅停車のみの走るローカル区間となった。

南雲新線

木屋浜本線の木急森駅から新南雲駅までの路線。駅数は9。南雲ニュータウンの開発を受け開通。上下分離方式を採用し、施設は南雲高速鉄道が管理する。全区間でアセラ長折線と競合関係にあるほか、都心部と南雲間では参急線とも競合関係にある。

温園線

木屋浜本線の温園駅から温園マリンパーク駅までの路線。駅数は3。温園マリンパークの開業に合わせ温園港への路線の一部を移設しアクセス路線として開業。温園止まりの列車が直通する。

中屋線

木屋浜本線の中屋橋駅から海屋駅までの路線。駅数は8。全区間でアセラ木屋線と競合する。朝晩は中央直通の急行も運転され都心部との通勤輸送を担う。海沿いを走ることもあり夏場には海水浴客で賑わい、多くの臨時列車が運転される。

松尾線

木屋浜本線の木屋松尾駅から松尾浜駅までの路線。駅数は7。軽便鉄道を発端するため急カーブが多い。2012年に直通急行が廃止となり、現在は各駅停車のみが走る。

潮草線

木屋浜本線の久得市駅から潮草駅までの路線。駅数は7。木屋半島を横断する路線で潮草ではアセラ木屋線と接続する。潮草線の存在により潮草町は久得市や折川市等半島西部の町との結びつきが強いため、特急なみかぜや快速急行、急行等本線との直通運転も多く実施している。

木屋港線

木屋浜本線の木急木屋駅から袋京町駅までの路線。駅数は5。正式には木屋浜本線の一部である。江崎駅ではアセラ木屋線に接続し、一部の特急とうなみが止豆駅まで乗り入れる。

都田線

西穴井駅から和知駅までの路線。駅数は11。社内の接続路線は無いという名鉄瀬戸線や西武多摩川線のような存在。沿線は宅地が多く、始点の西穴井、中間の川中子、終点の和知と都心へ向かう路線と接続するため、朝晩を中心に混雑は激しい。

　線内の川中子駅〜六椎駅間には川中子検車区が置かれている。飛び地路線ではあるが専用の車両は所属せず、定期的にアセラ東潮線の穴井〜西穴井間で甲種輸送を行い車両の交換を行う。一般車の8連に対し、都田線は有効長が6連であるため、走行距離の調整として8連と4連それぞれ1組で輸送され、川中子検車区内で組み替えが行われる。

木屋市内線

木屋市内の軌道線。佐久島線、江崎線、広竹線からなり、駅数は計38。木屋市内、アセラ、木急の各駅や木屋の沿岸部、中心街、住宅地を広く結ぶ。木屋本線の木屋〜木屋神宮から市内線木屋駅へ連絡線が存在し、専用の30系及び、50系を用いた新木屋から佐久島への直通列車も存在する。

列車種別

2020年7月現在、以下の列車種別が特徴的となっている。

南雲急行

南雲高速線に必ず乗り入れる急行列車。新三川発と潮羽線直通の列車があり、日中は毎時2本交互に運転される。

潮羽急行

セントラルメトロ潮羽線に必ず乗り入れる急行列車。日中は毎時2本運転。(もう1本は南雲急行となり合計20分毎に運転)温園から中屋橋までは各駅停車となる。

南港快速

セントラルメトロ南港東線に必ず乗り入れる快速列車。南港東線内は各駅に停車する。

特急列車

City Link とうなみ

アセラ中央駅から灯夏鉄道線に乗り入れる。

とうなみ

代表的な特急列車。

なみかぜ

とうなみを補完する特急列車。とうなみより停車駅が多く主に朝晩に運転される。

南雲ライナー

南雲高速線乗り入れる特急。朝晩のみの運転。

その他の列車種別

データとして判明しているものを挙げる。

快速急行

一般車で運転される中での最上位種別、深夜帯など一部を除き新三川から木屋までの全区間通しで運転されるほか、全日を通した一部列車は木屋港線に直通、朝晩の一部は中屋線、潮草線にも直通する。12両での運転も多く、この場合は中屋橋にて（付属編成が潮草線直通の場合は久得市にて）分割と併合が行われる。全区間通して速達性が重視され、新三川〜木屋間を平均104分で結ぶ。