元々彼は武士ではなく、武蔵国多摩郡の百姓の出身で、本名は宮川勝五郎。（後に副長となる土方歳三とはこの当時からの幼馴染。）幼少期から武家の世界に憧れを持ち、武士を目指すべく、天然理心流道場(試衛館)に入門。（この際、当時天然理心流宗家・三代目だった近藤周斎の実家である嶋崎家の養子となり、嶋崎勝太と名乗る。）そして、沖田総司や井上源三郎と知り合いその後、周斎の養子となり近藤勇と名乗り、宗家四代目を受け継ぐ。その後、つねと結婚し長女・たまを授かる。更に彼の下に山南敬助、永倉新八、原田左之助、藤堂平助、斎藤一など後に新選組の大幹部となる猛者たちが集まる。

文久三年（西暦1863年）三月頃、近藤は同志達と共に将軍の警護の為に、出羽浪士・清河八郎が創設した浪士組に参加、京都に向かう。しかし、浪士組の方針や筋道の違いから、清河と袂を分かち自身の一派と水戸脱藩浪士・芹沢鴨の一派と共に京に残り、京都守護職の会津藩主・松平容保の御預り組織・壬生浪士組（新選組の前身組織）を結成する。

結成当初は、芹沢や水戸派の新見錦と共に局長を務めていたが、芹沢達の度重なる乱暴狼藉に頭を抱えていた会津藩の勅命によって、試衛館派の土方や沖田ら同志たちと共に芹沢一派を粛清したことで、晴れて新選組の（二代目）局長の座を務めることとなった。

その後、池田屋事件では、自ら隊を率いて先陣を切り、多くの倒幕派志士を討ち取り無傷で生還する。その後、禁門の変や数々の事件で多くの倒幕派志士を弾圧し、更に伊東甲子太郎など有望な志士達を迎え入れ、新選組を大組織へと拡大させる。そして、後に晴れて幕府直参・旗本となり、念願だった武家の身分を手にするが、15代将軍・徳川慶喜が大政奉還を行ったことで、260年近く続いた徳川幕府の世が幕を下ろしてしまう。その後、思想の違いから脱退し、御陵衛士となった伊東らを殲滅し、油小路事件を起こす。しかし、この事件が仇となり、近藤は二条城からの帰還中に武田街道で待ち構えていた衛士の残党に襲撃され、右肩を負傷する。島田魁ら隊士の奮闘で、伏見奉行所まで何とか逃げ延びるも大阪城へ傷の治療のため隊を土方らに託し戦線離脱する。

その後、鳥羽伏見の戦いで井上を始めとした多くの隊士が戦死し、新選組は敗退する。その後、多くの隊士達と共に船で江戸まで帰還し、甲州勝沼の戦いで新政府軍を迎え撃つも敗北。更に価値観が合わなくなり、永倉や原田ら数名の隊士が離隊し、流山で新政府軍に追い詰められる。

近藤は、隊士達を救う為に土方に新選組を託し、敵軍に投降する。そして、江戸板橋にて斬首された。享年35。